β-1,3-1,4-葡聚糖酶活測定試劑盒

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本試劑盒僅供科研使用 1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-glucanase）酶活試劑盒說明書 （貨號：WS4750F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： β-1,3-1,4-葡聚糖酶（又稱地衣多糖酶；EC 3.2.1.73）是一類重要的水解酶，可以水解谷物 中的β-1,3-1,4-葡聚糖，其在食品、飼料和紡織等領(lǐng)域的具有重要應(yīng)用價值。 β-1,3-1,4-葡聚糖酶水解底物葡聚糖產(chǎn)生還原性糖。利用 3,5-二硝基水楊酸測定還原糖的 量，在 540nm 讀取吸光值，進而得出β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水，80℃ 水浴 10min 充分溶解，冷卻至 室溫待用。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、可調(diào)試移液器、臺式離心機、水浴 鍋、移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-GA）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內(nèi)，加入 1mL 提取液，在冰上進 行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 [注】：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細菌/真菌樣本： 先收集細菌/真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 280 300 試劑二 20 37℃孵育 30min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 300 300 混勻，95℃水浴 5min，取出后用自來水或冰水冷卻至 室溫，取全部澄清液體至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm） 中，在 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定管-A 對照 管（每個樣本做一個對照管）。 【注】:若ΔA 在零附近徘徊，可在樣本制備時加大取樣質(zhì)量 W（如增至 0.5g）,或在上機檢測 時加大上樣量 V1（由 100μL 增加到 200μL，則試劑一相應(yīng)減少，保持總體積不變）， 或延長反應(yīng)時間 T（如增至 60min）,則改變后的 W、V1 和 T 需帶入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.0087x - 0.0408；x 為標準品濃度（μg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087]÷(V1×Cpr) ÷T =38.3×(ΔA+0.0408)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織樣本每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087]÷(W×V1÷V) ÷T =38.3×(ΔA+0.0408)÷W 4、按細菌/真菌數(shù)量計算： 酶活定義：每 1 萬個細菌或真菌每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min /104 cell)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087]÷(500×V1÷V) ÷T=0.08×(ΔA+0.0408) 5、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體中每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087]÷(V1×Cpr) ÷T=38.3×(ΔA+0.0408)÷Cpr V---提取液體積，1mL； V1---樣本上樣體積，100μL =0.1mL； T---反應(yīng)時間，30min； W---樣本鮮重，g； 500---細菌/真菌總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品（1mg/mL）：從標準品管中稱量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL。也可 根據(jù)實際樣本來調(diào)整標準品濃度。 3 依據(jù) 100μL 標準品+300μL 試劑一+300μL 試劑三，混勻 95℃水浴 5min，取出后用 自來水或冰水冷卻至室溫，取全部澄清液體至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，在 540nm 處讀取吸光值 A，根據(jù)結(jié)果即可制作標準曲線。