肌酸激酶(CK)試劑盒

肌酸激酶(CK)試劑盒

肌酸激酶(CK)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）測定試劑盒說明書 （貨號:WS5580F 紫外分光法 48 樣） 一、產品簡介： 肌酸激酶（CK，EC 2.7.3.2）主要存在于心臟、肌肉及腦等組織中，能可逆地催化 肌酸與 ATP 之間的轉磷酰基反應，在能量運轉、肌肉收縮和 ATP 再生中有重要作用。 CK 催化磷酸肌酸和 ADP 生成肌酸和 ATP，通過添加的己糖激酶與 6-磷酸葡萄糖 脫氫酶復合體，依次催化 ATP 的水解與并伴隨著 NADPH 的生成，通過檢測 NADPH 在 340nm 處吸光值的增加即可得出 CK 酶活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉劑落到底部， 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑二 粉劑×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下，使粉劑落到底部， 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑三 液體 16mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑×4 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉劑落到底部， 每支加 0.3mL 蒸餾水充分溶解。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、低溫離心機、可調式移液器、恒 溫培養箱、研缽。 四、肌酸激酶（CK）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿，轉移至 EP 管中，12000rpm, 4℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液(mL)為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁則離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 紫外分光光度計預熱 30min，設定溫度至 37℃，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。 ② 所有試劑可預先在 37℃條件下預溫 5min。 ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 80本試劑盒僅供科研使用 2 【注】1.若 A 測定大于 1.5，則可減少反應時間 T（如減至 10min）再讀取 A2，或減少樣本加樣量 V1 （如減至 40μL, 則試劑三相應增加），則改變后的 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 2.若△A 的值小于 0.01，則可增大樣本體積 V1（如增至 160μL 或更多，則試劑三相應減少）， 或延長反應時間 T（如增至 30min 或更長），則改變后的 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按組織蛋白含量計算： 定義：37℃條件下，每毫克蛋白質在每分鐘內催化產生 1nmoLNADPH 為一個酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=93.8×ΔA÷Cpr 2、按組織樣本質量計算： 定義：37℃條件下，每克樣品在每分鐘內催化產生 1nmoLNADPH 為一個酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1÷V×W)÷T=93.8×ΔA÷W 3、按細胞數量計算： 定義：37℃條件下，每 104個細胞每分鐘內催化產生 1nmoLNADPH 為一個酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.19×ΔA 4、按血清計算： 定義：37℃條件下，每毫升液體在每分鐘內催化產生 1nmoLNADPH 為一個酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=93.8×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.08mL； V2---反應體系總體積，7×10-4 L； d---光徑，1cm； ε---NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L/moL/cm； W---樣本質量，g； T---反應時間，15min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。 試劑一 20 試劑二 20 試劑三 560 37℃條件下孵育 20min， 試劑四 20 混勻，37℃條件下，立即于 340nm 處讀取 A1，15min 后讀取 A2，△A= A2-A1。