普魯蘭酶活性測定試劑盒

普魯蘭酶活性測定試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 

 普魯蘭酶活性測定試劑盒說明書 

（貨號：WS8750F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 普魯蘭酶是一種水解酶，廣泛存在于微生物及動物、植物體內(nèi)，能專一地分解淀粉和 糖原及其衍生物分枝點的α-1.6-葡萄糖昔鍵。它的這種特性最早被用于淀粉結(jié)構(gòu)的理論研 究，到七十年代,普魯蘭酶的應(yīng)用已擴展到淀粉糖漿、啤酒和酒精生產(chǎn)等多個淀粉深加工 領(lǐng)域，并逐步從實驗室階段走向工業(yè)化規(guī)模。 普魯蘭酶催化普魯蘭分解產(chǎn)生還原糖，進一步與 3,5－二硝基水楊酸反應(yīng)，生成棕紅色 氨基化合物，經(jīng)光譜掃描在 540nm 有特征光吸收，在一定范圍內(nèi) 540nm 光吸收值與還 原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算普魯蘭酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加入 12mL 試劑一充分溶解備 用；用不完的試劑 4℃保存; 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液 器、研缽、冰和蒸餾水。 四、普魯蘭酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱樣本 0.1g（水分充足的樣本可取 0.5g）于研缽中，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿后 轉(zhuǎn)入離心管中。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 液體樣本：直接測定。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： 1 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 20 （95℃煮沸 10min 的酶液） 試劑二 100 100 混勻，50℃孵育 30min 試劑三 100 100 混勻，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊，以防止水分散失）， 流水冷卻至室溫。 蒸餾水 500 500 混勻，全部液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，于本試劑盒僅供科研使用 2 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA＝A 測定-A 對照（每個樣本做一 個自身對照）。 【注】：1.若 A 測定管的吸光值大于 2，可以用蒸餾水對整個顯色混合液用蒸餾水進行稀釋（如取 顯色混合液 360μL 至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，再加 360μL 蒸餾水，即稀 釋 2 倍），則稀釋倍數(shù) D 需代入公式計算。或減少上清液體積 V1（如減至 10μL，則加 10μL 蒸餾水補齊），則 V1 需代入公式重新計算。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 40μL，則最后蒸餾水體積相 應(yīng)減少，保持反應(yīng)總體積不變），或延長 50℃孵育時間 T（如增至 60min），則相應(yīng)的 V1 和反應(yīng)時間 T 需代入公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標準曲線方程為 y = 13.144x - 0.0644；x 為標準品質(zhì)量（mg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 普魯蘭酶活性（μg/min /mg prot）=[(ΔA+0.0644)÷13.144×103]÷(V1×Cpr ) ÷T =126.8×(ΔA+0.0644)÷Cpr 3、按鮮重計算： 單位定義：37℃每克組織每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 普魯蘭酶活性（μg/min /g 鮮重）=[(ΔA+0.0644)÷13.144×103]÷(W×V1÷V2) ÷T =126.8×(ΔA+0.0644)÷W 4、按液體樣本計算： 單位定義：37℃每毫升液體樣本每分鐘產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 普魯蘭酶活性（μg/min /mL 液體）=[(ΔA+0.0644)÷13.144×103]÷V1 ÷T =126.8×(ΔA+0.0644) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL； T---反應(yīng)時間，30min； W---樣本鮮重，g； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的蛋白含量(考馬斯亮藍法)試劑盒，不 建議使用蛋白含量(BCA 法) 試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根據(jù)實際樣本來 調(diào)整標準品濃度。 3 按照：20μL 標準品+100μL 蒸餾水+100μL 試劑三，95℃水浴 10min，冷卻后，再加 500μL 蒸餾水，混勻，全部液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，540nm 下 測定，根據(jù)結(jié)果即可制作標準曲線。