半纖維素酶/木聚糖酶試劑盒

半纖維素酶/木聚糖酶試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 半纖維素酶/木聚糖酶測定試劑盒說明書 （貨號：WS9070F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 半纖維素酶主要檢測木聚糖酶活力，可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總 稱，廣泛應用于釀造和飼料工業中。 半纖維素酶在酸性下將木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，進一步與 3,5-二硝基水楊酸 發生顯色反應，在 540nm 處有特征吸收峰，反應液顏色深淺與酶解產生的還原糖量成 正比，通過測定反應液在 540nm 吸光值增加速率，即可計算該酶活力大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 60mL 液體×1 瓶 4℃保存 試劑一 25mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 再加 12.5mL 試劑一溶解備用。 試劑三 21mL×1 瓶 -20℃保存 標準品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、低溫離心機、恒溫水浴鍋、可調式移液器。 四、半纖維素酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織：稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經預冷的 95%乙醇冰浴 勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經 預冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 經預冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 細菌/培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：澄清液體直接檢測，若渾濁則 12000rpm，4℃，離心 15min，取上清待測。 2、上機檢測： 1 可見分光光度計預熱 30min，調節波長至 540nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 100 100 試劑二 100 40℃孵育60min 試劑二 100 試劑三 200 200 混勻，沸水浴（95-100℃）5min，冷卻至室溫 蒸餾水 200 200本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，取出全部澄清液體至1mL玻璃比色皿（光徑1cm）中，于 540nm處讀取A，ΔA=A測定-A對照（每個測定管設一個對照管）。 【注】1. 若 A 值大于 1.5，最后一步檢測時可進行稀釋：如取 350μL 待檢液至比色皿中，再加 350μL 蒸餾水，相當于稀釋倍數 D 為 2，需帶入計算公式參與計算。 2. 若ΔA 小于 0.01，則可增加樣本加樣體積 V1（如增至 200μL，則試劑一減少為 0μL）， 則改變后的 V1 代入公式計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 1.4174x - 0.0429，x 是標準品摩爾質量（μmol），y 是△A。 2、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產生 1nmol 木糖所需酶量為一個酶活單位。 半纖維素酶活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103]÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =117.6×(ΔA+0.0429)÷Cpr×D 3、按樣本重量計算： 酶活定義：每克樣本每分鐘分解木聚糖產生 1nmol 木糖所需酶量為一個酶活單位。 半纖維素酶活力(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103] ÷(W×V1÷V)÷T×D =117.6×(ΔA+0.0429)÷W×D 4、按細菌/細胞密度計算： 酶活定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘分解木聚糖產生 1nmol 木糖所需酶量為一酶活單 位。 半纖維素酶活力(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103]÷(500×V1÷V)÷T×D =0.235×(ΔA+0.0429)÷W×D 5、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體樣本每分鐘分解木糖產生 1nmol 木糖所需酶量為一個酶活單位。 半纖維素酶活力(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103] ÷V1÷T×D =117.6×(ΔA+0.0429)×D V---提取液體積，1mL； V1---樣本體積，0.1mL； T---反應時間，60min； W---樣本質量，g； 木糖分子量---150.131； D---稀釋倍數，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4,0.6,0.8, 1. mg/mL。 3 100μL 標準品+100μL 試劑一+100μL 蒸餾水+200μL 試劑三，混勻，沸水浴（95-100℃） 5min，冷卻至室溫，再加 200μL 蒸餾水，混勻后取出全部液體至 1mL 玻璃比色皿（光 徑 1cm）中，于 540nm 處讀取吸光值 A。根據結果即可制作標準曲線。

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