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          Na+k+—ATP酶試劑盒,微板法

          更新時間:2024-06-20

          簡要描述:

          Na+k+—ATP酶試劑盒,微板法
          Na+K+ - ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中,可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機磷。通過測定無機磷的量來確定該酶活性大小。

          Na+k+—ATP酶試劑盒,微板法

          Na+k+—ATP酶試劑盒,微板法

          本試劑盒僅供科研使用 1 Na+K+ - ATP 酶活性測定說明書 (貨號:WS9580W 微板法 48 樣) 一、產品簡介: Na+K+ - ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中,可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機磷。通過測定無機磷的量來確定該酶活性大小。 二、所需的儀器和用品: 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 三、試劑盒的組成和配制: 【注】:全程操作需無磷環境;試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿, 避免磷污染。 四、Na+K+ -ATP 酶活性檢測: 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定,了解本批樣品情況,熟悉實驗流程,避免實 驗樣本和試劑浪費! 1、樣本制備: ① 組織樣本: 稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min取上清,置冰上待測。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質量(g):提取液體積(mL)1:5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/細胞樣本: 先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 【注】:若增加樣本量,可按照細菌/細胞數量(104):提取液(mL)500~1000:1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本:直接檢測;若渾濁,離心后取上清檢測。 2、上機檢測: ① 酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 700nm,所有試劑解凍至室溫(25℃)。 ② 在 EP 管中依次加入: 試劑名稱(μL測定管 對照管 試劑一 100 100 樣本 100 試劑二 100 100 37℃ 孵育 20min 試劑三 40 40 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 提取液 90mL×1 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 20mL 提取液,混勻溶解備用。 試劑二 粉體×1 -20℃用前甩幾下使試劑落入底部,再加 15mL 提取液,混勻溶解備用。 試劑三 液體 4mL×1 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 B:液體 2mL×1 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 1.8mL B 液, 再加23.2mL的蒸餾水,混勻溶解備用。 標準品 粉體 mg×1 4℃保存 若重新做標曲,則用到該試劑本試劑盒僅供科研使用 樣本 100 混勻,12000rpm4℃離心 5min,上清液待測 ③ 顯色反應: 五、結果計算: 1、標準曲線方程:y = 0.6402x - 0.0034x 是標準品摩爾質量(μmol/mL, y A2、按蛋白濃度計算: 定義:每小時每毫克組織蛋白分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(V1×Cpr)÷T=15.93×(A+0.0034)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算: 定義:每小時每克組織分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(W×V1÷V)÷T=15.93×(A+0.0034)÷W 4、按細菌或細胞密度計算: 定義:每小時每 1 萬個細菌或細胞分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/104 cell)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(A+0.0034) 5、液體中 Na+K+ -ATPase 活力計算: 定義:每小時每毫升液體分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0034)÷0.6402×V2]÷V1÷T=15.93×(A+0.0034) V---加入提取液體積,1mLV1---加入樣本體積,0.1mL V2---酶促反應總體積,0.34mLT---反應時間,1/3 小時; W---樣本鮮重,g500---細菌或細胞總數,500 萬; Cpr---樣本蛋白質濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附:標準曲線制作過程: 1 制備標準品母液(50μmol/mL):標準品用 1mL 提取液溶解。(母液需在兩天內用)。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標準品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據實際樣 本來調整標準品濃度。 3 依據顯色反應階段測定管的加樣體系操作,根據結果即可制作標準曲線。 上清液 50 50 試劑四 200 200 混勻,室溫靜置 3min700nm 下讀取各管吸光值, A=A 測定-A 對照(每個樣本做一個自身對照)。

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