多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果膠酶試劑盒微板法

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果膠酶試劑盒微板法

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果膠酶試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase，PG）試劑盒說明書 （貨號：WS1070W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 果膠酶是指分解果膠的多種酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果膠裂解酶(PL),果膠 甲酯酶(PME)和原果膠酶，貯藏過程中起作用的主要是 PG。所以該酶在食品貯藏保鮮和 植物抗病性等領域具有較高的研究價值。 果膠在多聚半乳糖醛酸酶(PG)作用下，能水解產生帶有具有還原性醛基的半乳糖醛酸。 與 DNS 試劑反應生成紅棕色物質，在 540nm 有特征吸收峰，測定 540nm 處吸光值變化 可計算得多聚半乳糖醛酸酶活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、天平、可調式移液器、恒溫水浴鍋、研缽、冰。 四、多聚半乳糖醛酸酶(PG)的測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經預冷的 95%乙醇冰浴勻 漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經預 冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再 向沉淀中加入 1mL 經預冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 細菌/培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或 細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 20 試劑一 130 試劑二 130 40℃水浴 30min本試劑盒僅供科研使用 2 【注】若△A 在零附近徘徊，可增加樣本上樣量 V1（如增加至 50μL，則試劑一或二相應減少）， 或延長反應時間 T（如增至 1h），則改變后的 V1 和 T 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 18.053x - 0.0263：x 為標準品質量，mg；y 為△A。 2、按照蛋白濃度計算： 酶活定義：在 40℃，每毫克蛋白每小時分解果膠酸產生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位。 PG 活性(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1×Cpr)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷Cpr 3、按照樣本質量計算： 酶活定義：在 40℃，每克樣本每小時分解果膠酸產生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位（U）。 PG 活性(mg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×W)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷W 4、按細菌/細胞密度計算： 酶活定義：在 40℃，每 1 萬個細菌或細胞每小時分解果膠酸產生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶 活力單位（U）。 PG 活性(mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×500)÷T=0.011×(ΔA+0.0263) 5、按液體體積計算： 酶活定義：在 40℃，每毫升液體每小時分解果膠酸產生 1mg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位 PG 活性(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷V1÷T=5.54×(ΔA+0.0263) V---加入提取液體積，1mL； V1---反應中樣本體積，0.02mL； W---樣本質量，g； T---反應時間，0.5h; 500---細菌或細胞總數，500 萬； Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液(10mg/mL)：向標準品 EP 管里面加入 1mL 的蒸餾水（母液需在兩 天內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成五個濃度梯度的標準品：0，1，2，3，4，5.mg/mL。也可根據實際樣 本來調整標準品濃度。 3 依據測定管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。 試劑三 150 150 沸水浴（95-100℃）5min，冰浴或淋浴冷卻后，取 200μL 于 96 孔板中，540nm 處測定吸光值 A，△A=A 測定管-A 對照管（每個測定管設一個對照管）。