葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)試劑盒微板法

葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)試劑盒微板法

葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)試劑盒說明書 （貨號：WS2160W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)是卡爾文循環中的關鍵酶。催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 反應產生 1,3-二磷酸甘油酸，后者在 3-磷酸甘油醛脫氫酶和 NADH 作用下產生 3-磷酸甘 油醛和 NAD+，通過測定 NADH 的下降量，進而得到 3-磷酸甘油酸激酶的活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液一 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×3 支 4℃保存 用前取一支甩幾下或離心使試劑 落入底部，再加 0.4mL 蒸餾水溶解 備用。 試劑三 液體μL×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、可調式移液器、天平、震蕩儀、低溫離心機、研缽。 四、葉綠體 3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 植物組織樣本，加入 1mL 提取液一，快速冰浴勻漿后于 4℃，1600rpm 離 心 5min，棄沉淀，取上清再 4℃，5000rpm 離心 15min，棄上清留沉淀，向沉淀中加 1mL 提取液二，強力渦旋震蕩 15s，置于冰上(或冰箱)在 4℃孵育 15min，4℃，13000rpm 離心 5min，取上清測定葉綠體中 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的酶活性。提示：整個葉綠體的提取 過程須保持 4℃低溫環境。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min，調節波長至 340nm，設定溫度 25℃。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 10本試劑盒僅供科研使用 2 【注】1.若△A 的值在零附近，可以適當延長反應時間到 20min 后讀取 A2，改變后的反應時間需代 入計算公式重新計算?；蜻m當加大樣本量(如 40μL，則試劑四相應減少)，則改變后的加 樣體積需代入計算公式重新計算。 2. 若下降趨勢不穩定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時間段來參與 計算，相對應的 A 值也代入計算公式重新計算。 3. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對會 偏高），可以適當減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計算公式重新計算。 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于 檢測； 4. 若ΔA 的值大于 0.5，則需減少反應時間（如減少至 5min），或減少樣本量（如 10μL）， 則改變后的反應時間 T 和樣本量 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按照樣本質量計算 酶活定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GPK（nmol/min/g 鮮重）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W×V1÷V) ÷T=321.6×ΔA÷W 2、按樣本蛋白濃度計算 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內氧化 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 NADH-GPK（nmol/min/mg prot）= [ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=321.6×ΔA÷Cpr ε---NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應體系總體積，0.2mL=2×10-4L； T---反應時間，10min； W---樣本質量，g。 試劑四 140 混勻，室溫（25℃）條件下，孵育 10min 試劑五 10 輕輕混勻，室溫（25℃）條件下，30s 時于 340nm 處讀取吸光值 A1，10min 后再讀取 A2， ΔA=A1-A2。