丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）試劑盒微板法

丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）試劑盒微板法

丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 丙酮酸磷酸雙激酶( PPDK)活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS1160W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK，EC 2.7.9.1)是C 4途徑和景 天科植物的一個(gè)重要限速酶，催化CO 2的原初受體磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的形成，對植 物光合作用具有重要調(diào)節(jié)作用。 丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)逆向催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和 Ppi生成丙酮酸、ATP 和Pi。偶聯(lián)乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。因此通過檢測340nm 處NADH的下降速率，即可得出PPDK的酶活性大小。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再分別加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 試劑三 粉劑 mg×3 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 每支分別加 0.44mL 蒸餾水溶解備用。 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑四 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再加 2.2mL 蒸餾水溶解（可超聲加速 溶解），備用。 試劑五 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部， 再分別加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑四 20 試劑五 130 試劑六 10 混勻，室溫（25℃）條件下，立即于 340nm 處讀取 A1，5min 后讀取 A2。△A=A1-A2。 【注】 1.若△A 在零附近，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 10min 或更長讀取 A2）。或適當(dāng)加大樣 本量 V1（如增至 20μL，則試劑五相應(yīng)減少），則改變后的 T 或 V1 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高），可減少樣本加樣 量 V1（如減至 5μL，則試劑五相應(yīng)增加），則改變后的 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于檢測； 3. 若ΔA 的值大于 0.5，則需減少反應(yīng)時(shí)間 T（如減少至 1min），則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 需代 入計(jì)算公式重新計(jì)算。 4. 若下降趨勢不穩(wěn)定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來參與 計(jì)算，相對應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PPDK 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =1286.2×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PPDK 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T =1286.2×ΔA÷W V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，5min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。