植物果糖1,6二磷酸(酯)酶(FBP)試劑盒微板法

植物果糖1,6二磷酸(酯)酶(FBP)試劑盒微板法

植物果糖1,6二磷酸(酯)酶(FBP)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 植物果糖-1,6-二磷酸（酯）酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP) 試劑盒說明書 （貨號：WS5060W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 果糖-1,6 二磷酸酶又稱果糖 1,6 二磷酸酯酶（FBP，EC 3.1.3.11），有兩種 FBPase 存在于 光合細胞中。胞質型 FBP 主要存在于細胞質，參與蔗糖合成和糖異生途徑；葉綠體型 FBP 存在于葉綠體中，它在二氧化碳同化途徑中發揮調節作用。 FBP 催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和無機磷，接著與酶促復合物相互作用， 伴隨著 NADPH 的生成，通過檢測 NADPH 在 340nm 處的增加速率，進而計算出 FBP 酶活 性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液一 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 2.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽和蒸餾水。 四、果糖-1,6-二磷酸（酯）酶(FBP)活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實 驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 總FBP酶提?。?/span>建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液二進行冰浴勻漿，于4℃，13000rpm 離心5min，取上清液測定。 ② 胞漿和葉綠體 FBP 酶的分離： 稱取約0.2g樣本，加入1mL提取液一，快速冰浴勻漿后于4℃，1600rpm離心5min，棄 沉淀，取上清再4℃，5000rpm離心15min，取上清用于測定胞漿FBP酶活性，取沉淀加1mL 提取液二，強力渦旋震蕩15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃，13000rpm離心5min， 取上清測定葉綠體中FBP酶活性。提示：整個葉綠體的提取過程須保持4℃低溫環境。 建議測定總 FBP 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的 FBP，則按照步驟②提取粗酶液。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，設置溫度 25℃。 ② 試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管本試劑盒僅供科研使用 2 樣本 10 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150 輕輕混勻，室溫（25℃）孵育 5min 試劑四 20 混勻，于 340nm 處測定，10s 時讀取 A1，10min 后讀取 A2，ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 在零附近徘徊，可以延長至 20min 后重新讀取 A2，或則增加樣本量 V1（如增 至 20μL，則試劑三相應減少），則改變后的反應時間 T 或樣本量 V1 需重新代入計 算公司計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活性單位。 FBP(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T =643.1×ΔA÷Cpr 2、按照樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 FBP(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109] ÷(W×V1÷V)÷T =643.1×ΔA÷W V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01mL； V2---反應體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質量，g； T---反應時間，10min； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒。