磷酸葡萄糖變位酶 (PGM)試劑盒,微板法

磷酸葡萄糖變位酶 (PGM)試劑盒,微板法

磷酸葡萄糖變位酶 (PGM)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 磷酸葡萄糖變位酶（PGM）試劑盒說明書 （貨號：WS3650W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 磷酸葡萄糖變位酶（PGM）在碳水化合物代謝中起關鍵作用，并廣泛存在于所有生物 體中。PGM 可使葡萄糖-1-磷酸（G1P）和葡萄糖-6-磷酸（G6P）互變。當糖原分解時，PGM 將 G1P 轉化為 G6P，接著進入糖酵解途徑產生 ATP，也可通過戊糖磷酸途徑產生核糖和 NADPH。相反，當細胞需要能量時，PGM 將 G6P 轉化為 G1P，進而產生糖原。PGM 的 缺乏可導致與葡萄糖存儲相關的疾病。 本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方法：PGM 將葡萄糖-1-磷酸轉化為葡萄糖 -6-磷酸;葡萄糖-6-磷酸通過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶氧化形成 NADPH，接著與特異顯色劑反應 生成有色物質，通過檢測該有色物在 450nm 的增加速率，進而計算出 PGM 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑三 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 標準品 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰。 四、磷酸葡萄糖變位酶（PGM）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細胞樣本： 先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，設置溫度 37℃,調節波長至 450nm。 ② 試劑放在 37℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 10 試劑三 10 試劑四 150 混勻，37℃條件下孵育 10min 試劑五 10 混勻，37℃條件下，1min 時于 450nm 處讀取 吸光值 A1，11min 時讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】：1. 若ΔA 過小，可以延長反應時間 T（如：21min 或更長）再讀取 A2，或增加樣本量 V1（如 增至 20μL，則試劑四相應減小），重新調整的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 2. 若 A2 值大于 1.5，可縮減反應時間 T（如：6min 或更短）再讀取 A2，或減少樣本量 V1 （如減至 5μL，則試劑四相應增加），重新調整的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.0838x - 0.0173，x 是標準品摩爾質量：nmol，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘使 1nmol NADP+轉換成 1nmol NADPH 為一個酶活單位。 PGM（nmol/min /mg prot）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷ (V1×Cpr) ÷T=119.3×(ΔA+0.0173)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘使 1nmol NADP+轉換成 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 PGM（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(W×V1÷V) ÷T=119.3×(ΔA+0.0173)÷W 4、按細胞數量計算： 單位定義:每 104個細胞每分鐘使 1nmol NADP+轉換成 1nmol NADPH 定義為一個酶活單位。 PGM（nmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(500×V1÷V)÷T=0.24×(△A+0.0173) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； W---樣本質量，g； T---反應時間，10 min； Cpr----樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1nmol/μL）：向標準品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（母液需在兩 天內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. 0nmol/μL。也可根據實 際樣本來調整標準品濃度。 3 依據加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。