中性轉化酶(NI)/細胞質試劑盒,微板法

中性轉化酶(NI)/細胞質試劑盒,微板法

中性轉化酶(NI)/細胞質試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 中性/堿性轉化酶（Neutral invertase, NI）試劑盒說明書 （貨號：WS6150W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 蔗糖酶即蔗糖轉化酶（Invertase，E.C.3.2.1.26）在蔗糖代謝中催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，是高等 植物蔗糖代謝關鍵酶之一。根據最適 PH 值，蔗糖轉化酶分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）兩 種類型，許多報道均將中性轉化酶同堿性轉化酶看作一種轉化酶。NI 的最適 PH 值在 7.0 左右，主要存 在于細胞質中，負責分解細胞質中蔗糖為果糖和葡萄糖。 NI 催化蔗糖分解產生還原糖，進一步與 3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，經光譜掃 描在 540nm 有特征光吸收，在一定范圍內 540nm 光吸收值與還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速 率來計算 NI 活性 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前加入 7.5mL 試劑一充分溶 解備用；用不完的試劑 4℃保存; 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、中性/堿性轉化酶（NI）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱樣本 0.1g（水分充足的樣本可取 0.5g）于研缽中，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿后 轉入離心管中。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注意】 若樣本含糖量高，可引起 A 對照值較大如超過 1.6，即檢測背景值過高會影響檢測，可在樣本 制備過程中增加除糖步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 經預冷的 95%乙醇 冰浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經預冷的 80% 乙醇混勻，4℃放置 5min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 經預冷 提取液渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 40 40 試劑一 100 200 試劑二 100 混勻，37℃準確水浴 20min 后，95℃水浴 10min（用封口 膜纏緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保 證濃度不變）。 試劑三 100 100 混勻，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊，以防止水分散失）， 流水冷卻后充分混勻，吸取 200μL 轉移至 96 孔板中，本試劑盒僅供科研使用 2 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個測定 管需設一個對照管）。 【注】：1.若吸光值大于 1.5，可以用蒸餾水稀釋樣本后測定，計算公式中乘以相應稀釋倍數 D。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 80μL，則試劑一相應減少）， 或延長 37℃水浴時間（如增至 40min 或更長），則相應的 V1 和 T 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 0.0056x - 0.0153；x 為標準品質量（μg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 NI 活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.0153)÷0.0056]÷(V1×Cpr)÷T =223.2×(ΔA +0.0153 )÷Cpr 3、按鮮重計算： 單位定義：37℃每克組織每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 NI 活性(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0153)÷0.0056]÷(W×V1÷V2)÷T =223.2×(ΔA +0.0153 )÷W V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.04mL； T---反應時間，20min； W---樣本鮮重，g； Cp---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根據實際樣本來 調整標準品濃度。 3 按照：40μL 標準品+200μL 試劑一+100μL 試劑三，依次加樣操作，95℃水浴 10min， 冷卻后，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下測定，根據結果即可制作標準曲線。