淀粉去分支酶(DBE)試劑盒,微板法

淀粉去分支酶(DBE)試劑盒,微板法

淀粉去分支酶(DBE)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 淀粉脫分支酶（Starch debranching enzyme，DBE）試劑盒說明書 （貨號：WS0450W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 淀粉去分支酶(DBE)（EC 3.2.1.68）屬于淀粉水解酶家族，特異性地水解支鏈淀粉的 α-1，6 糖苷鍵，產生線性的葡萄糖鏈，在調整支鏈淀粉分子的鏈長方面有重要的作用。 采用 3，5-二硝基水楊酸法測定 DBE 催化支鏈淀粉產生的還原糖，通過測定還原糖 含量的變化來得到 DBE 酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使試劑落入底部，再加 24mL 試劑一，于 80℃水浴鍋中溶解呈透 明狀態，待冷卻后使用。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、可調式移液器、水浴鍋、臺式離心機、研缽、冰、蒸餾水 四、淀粉脫分支酶（DBE）活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取 上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 2、上機檢測： 1 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長到 540 nm。 2 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 20 （95℃煮沸 10min 的酶液） 試劑二 200 200 37℃孵育 30min 試劑三 280 280 試劑四 100 100 混勻，95℃顯色 10min 后，流水冷卻至室溫后，取出 200μL 至 96 孔板中，于 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA＝A 測定-A 對照。 【注】若ΔA 差值較小，可加大樣本量，或延長孵育時間至 1 小時或更長。本試劑盒僅供科研使用 2 則改變后的加樣量 V1 或反應時間 T 需重新代入公式計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 2.5359x - 0.0196，x 是標準品質量（mg），y 是ΔA。 2、按照蛋白濃度計算 酶活定義：每毫克組織蛋白每小時水解支鏈淀粉產生 1mg 還原糖（以麥芽糖計）定義為 一個酶活力單位。 DBE 活力(mg/h/mg prot)=[ (ΔA+0.0196)÷2.5359]÷(V1×Cpr)÷T =39.43× (ΔA+0.0196) ÷Cpr 3、按樣本鮮重計算 酶活定義：每克組織每小時水解支鏈淀粉產生 1mg 還原糖（以麥芽糖計）定義為一個酶 活力單位。 DBE 活力(mg /h/g 鮮重)=[ (ΔA+0.0196)÷2.5359]÷(W×V1÷V)÷T =39.43× (ΔA+0.0196) ÷W V----加入提取液體積，1 mL； V1----反應中樣品體積，20μL=0.02mL； W----樣品質量，g； T----反應時間，30min=0.5h； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（50mg/mL）：臨用前加 1mL 蒸餾水，充分溶解混勻。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0,5,10,15,20, 25mg/mL。也可根據實際樣本來 調整標準品濃度。 3 按照測定管加樣體系操作，依據結果即可制作標準曲線。