l 有效期：6個月
l 保存條件：2-8℃
使用目的
本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中I型膠原(Col-I)的含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人I型膠原(Col-I)水平。用純化的人I型膠原(Col-I)抗
體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入I型膠原(Col-I)，再與HRP標記的I型膠原(Col-I)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的I型膠原(Col-I)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人I型膠原(Col-I)濃度。
注意事項
l 本試劑盒僅用于科研，不得用于醫學診斷。
l 使用試劑盒，請仔細閱讀說明書，以試劑盒內的說明書為準，請務必理解說明書內容。
l 酶標包被板屬于可拆型，開封后如未用完，板條應裝入鋁箔袋密封并2-8°C保存。
l 加樣樣本和試劑應盡快完成。
l 避免實驗過程中酶標板干燥；清洗后盡快加試劑。
l 實驗開始，所有試劑應平衡到室溫 (21-26°C) 后方可進行。溫度會影響吸光度值，但不影響樣本值。
l 切忌用口加樣，以免試劑和樣本粘到皮膚和粘膜上。
l 不要在處理樣本或試劑的區域抽煙、吃東西、喝酒或化妝。
l 操作時帶次性手套，微生物的污染會影響實驗結果的正確性。
l 操作應按照家規定的安全條列進行。
l 過期的試劑盒切勿再使用。
l TMB 底物對皮膚有刺激性，不慎ru眼，立即用大量水沖洗，皮膚上不慎接觸到也應立即用肥皂， 并用大量的水沖洗。試驗中被污染的物品在下次使用應盡快清洗。
試劑盒組成
9. 終止液6ml×1瓶
10. 酶標試劑6ml×1瓶
11. 30倍濃縮洗滌液20ml×1瓶
需要而未提供的試劑和器材
l 吸光度值在450nm波長下檢測的酶標儀。
l 1-2ml的加樣器。
l 100 ml和1L的量筒。
l 吸水紙。
l 37°C 恒溫箱。
l 蒸餾水或去離子水。
l 數據分析和繪圖軟件，圖紙。
l 標準和樣品稀釋的試管。
儲存條件
u 有效期內的試劑如開封后未用完，請2-8°C 保存。
u 過期的試劑請不要用，打開后的試劑2-8°C 保存。
u 酶標包被板必須2-8°C 保存，如有未用完的酶標包被板，打開的鋁箔袋須密封并2-8°C 保存。
試劑準備
試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。
樣本處理及要求
1. 血清-用采血管收集血液，室溫血液自然凝固30分鐘，1000 xg離心15分鐘左右，收集上清，盡早
進行實驗，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存。
2. 血漿-收集好的血漿根據要求選擇EDTA或者檸檬酸鈉作為抗凝劑，2-8°C 1000 xg離心15分鐘左右，30分鐘內收集好，-20°C 或 -80°C 保存，避免反復凍融。
3. 細胞上清及相關液體-收集好的樣本離心后應盡快實驗，或者分裝后-20°C 或 -80°C 保存，避免反復凍融。
操作步驟
l 所有試劑和樣本使用必須在室溫下平衡，混勻試劑時不應起泡沫。
l 旦實驗開始，各操作步驟都應盡快完成。
l 避免重復使用手中的吸頭和試管，以免交叉污染。
l 般情況，酶的反應與時間和溫度成正比。
1. 標準品的稀釋：準備小試管 6 只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀釋液 100ul，然后取原濃度標準品 100ul 加入只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管中取 100ul 加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取 100ul 加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取 100ul 加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取 100ul， 棄掉。第六只試管作為 0 號標準品。稀釋后各管濃度分別是：4000pg/ml,2000pg/ml,1000pg/ml,500pg/ml,250pg/ml,0pg/ml,。
在酶標包被板上設標準品孔，依次加入不同濃度的標準品 50ul（建議每個濃度做 2 個平行孔）。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品、酶標試劑及生物素標記的抗 Col-I 抗體，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品 40μl，然后再加生物素標記的抗 Col-I 抗體 10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
5. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 后棄去，如此重復 5 次， 拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 10 分鐘。
8. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9. 測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15
分鐘以內進行。
10. 檢測范圍：50pg/ml-4000pg/ml。
11. 靈敏度：≤10pg/ml。
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，即為樣品的實際濃度。
